BDDE խաչաձեւ կապակցված ավտոկլավում ռեակցիայի նոր ենթամթերքների հայտնաբերում

Javascript-ը ներկայումս անջատված է ձեր դիտարկիչում:Երբ javascript-ն անջատված է, այս կայքի որոշ գործառույթներ չեն աշխատի:
Խավիեր Ֆիդալգո, * Պիեռ-Անտուան ​​Դեգլեն, * Ռոդրիգո Արոյո, * Լիլիան Սեպուլվեդա, * Եվգենյա Ռաննևա, Ֆիլիպ Դեպրեսի գիտության դեպարտամենտ, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empuries, Կատալոնիա, Իսպանիա * Այս հեղինակները որոշակի պատկերացումներ ունեն այս աշխատանքի վերաբերյալ: ներդրման նախապատմություն. Հիալուրոնաթթուն (HA) բնական պոլիսաքարիդ է, որն օգտագործվում է էսթետիկ նպատակներով մաշկի լցոնիչների արտադրության մեջ:Քանի որ այն ունի մի քանի օրվա կիսամյակ մարդու հյուսվածքներում, HA-ի վրա հիմնված մաշկային լցոնները քիմիական ձևափոխված են՝ երկարացնելու իրենց կյանքը մարմնում:Առևտրային HA-ի վրա հիմնված լցոնիչներում ամենատարածված փոփոխությունը 1,4-բուտանեդիոլ դիգլիցիդիլ եթերի (BDDE) օգտագործումն է որպես HA շղթաները խաչաձև կապող միջոց:Մնացորդային կամ չհակազդված BDDE-ն համարվում է ոչ թունավոր՝ <2 մաս/մլն (ppm) չափով;հետևաբար, մաշկային վերջնական լցանյութում մնացորդային BDDE-ն պետք է քանակականացվի՝ հիվանդի անվտանգությունն ապահովելու համար:Նյութեր և մեթոդներ. Այս ուսումնասիրությունը նկարագրում է BDDE-ի և HA-ի միջև խաչաձև կապող ռեակցիայի հայտնաբերումն ու բնութագրումը ալկալային պայմաններում՝ համատեղելով հեղուկ քրոմատագրությունը և զանգվածային սպեկտրոմետրիան (LC-MS):Արդյունքներ․LC-MS վերլուծությունը հաստատեց, որ կողմնակի արտադրանքն ունի նույն մոնիզոտոպային զանգվածը, ինչ BDDE-ն, պահպանման այլ ժամանակ (tR) և ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման կլանման այլ ռեժիմ (λ=200 նմ):Ի տարբերություն BDDE-ի, LC-MS վերլուծության ժամանակ նկատվել է, որ նույն չափման պայմաններում այս կողմնակի արտադրանքն ունի ավելի բարձր հայտնաբերման արագություն 200 նմ-ում:Եզրակացություն. Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ այս նոր միացության կառուցվածքում էպօքսիդ չկա:Քննարկումը բաց է գնահատելու այս նոր ենթամթերքի ռիսկը, որը հայտնաբերված է HA-BDDE հիդրոգելի (HA մաշկային լցոնիչ) արտադրության մեջ առևտրային նպատակներով:Հիմնաբառեր՝ հիալուրոնաթթու, HA մաշկի լցոնիչ, խաչաձեւ կապակցված հիալուրոնաթթու, BDDE, LC-MS վերլուծություն, BDDE ենթամթերք:
Հիալուրոնաթթվի (ՀԱ) վրա հիմնված լցոնիչները ամենատարածված և տարածված մաշկի լցոններն են, որոնք օգտագործվում են կոսմետիկ նպատակներով:1 Այս մաշկային լցոնիչը հիդրոգել է, որը սովորաբար բաղկացած է >95% ջրից և 0,5-3% HA-ից, ինչը նրանց տալիս է գելանման կառուցվածք:2 HA-ն պոլիսախարիդ է և ողնաշարավորների արտաբջջային մատրիցայի հիմնական բաղադրիչը։Բաղադրիչներից մեկը.Այն բաղկացած է (1,4)-գլյուկուրոնաթթու-β (1,3)-N-ացետիլգլյուկոզամին (GlcNAc) կրկնվող դիսաքարիդային միավորներից՝ կապված գլիկոզիդային կապերով։Այս դիսաքարիդային օրինաչափությունը նույնն է բոլոր օրգանիզմներում:Համեմատելով որոշ սպիտակուցների վրա հիմնված լցոնիչների (օրինակ՝ կոլագենի) հետ՝ այս հատկությունը ՀԱ-ն դարձնում է բարձր կենսահամատեղելի մոլեկուլ:Այս լցոնիչները կարող են դրսևորել ամինաթթուների հաջորդականության առանձնահատկությունը, որը կարող է ճանաչվել հիվանդի իմունային համակարգի կողմից:
Երբ օգտագործվում է որպես մաշկի լցահարթիչ, HA-ի հիմնական սահմանափակումը նրա արագ շրջանառությունն է հյուսվածքներում՝ պայմանավորված ֆերմենտների հատուկ ընտանիքի առկայությամբ, որոնք կոչվում են հիալուրոնիդազներ:Մինչ այժմ նկարագրվել են ՀԱ կառուցվածքի մի քանի քիմիական փոփոխություններ, որոնք մեծացնում են ՀԱ-ի կիսամյակը հյուսվածքներում:3 Այս փոփոխություններից շատերը փորձում են նվազեցնել հիալուրոնիդազի հասանելիությունը պոլիսախարիդային պոլիմերներին՝ խաչաձև կապելով HA շղթաները:Հետևաբար, HA կառուցվածքի և խաչաձև կապող նյութի միջև կամուրջների և միջմոլեկուլային կովալենտային կապերի ձևավորման շնորհիվ խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելը արտադրում է ավելի շատ հակաֆերմենտային քայքայման արտադրանք, քան բնական HA-ն:4-6
Մինչ այժմ, խաչաձև HA արտադրելու համար օգտագործվող քիմիական նյութերը ներառում են մետակրիլամիդ, 7 հիդրազիդ, 8 կարբոդիիմիդ, 9 դիվինիլ սուլֆոն, 1,4-բուտանեդիոլ դիգլիցիդիլ եթեր (BDDE) և պոլի(էթիլեն գլիկոլ) դիգլիցիդիլ եթեր:10,11 BDDE-ն ներկայումս ամենատարածված օգտագործվող խաչաձեւ կապող միջոցն է:Թեև հիդրոգելների այս տեսակները տասնամյակներ շարունակ ապացուցված են, որ անվտանգ են, օգտագործվող խաչաձև կապող նյութերը ռեակտիվ ռեակտիվներ են, որոնք կարող են լինել ցիտոտոքսիկ և, որոշ դեպքերում, մուտագեն:12 Հետևաբար, դրանց մնացորդային պարունակությունը վերջնական հիդրոգելում պետք է լինի բարձր:BDDE-ն համարվում է անվտանգ, երբ մնացորդային կոնցենտրացիան 2 մաս/միլիոնից պակաս է (ppm):4
HA հիդրոգելներում ցածր մնացորդային BDDE-ի կոնցենտրացիայի, խաչաձեւ կապի աստիճանի և փոխարինման դիրքի հայտնաբերման մի քանի մեթոդներ կան, ինչպիսիք են գազային քրոմատոգրաֆիան, չափի բացառման քրոմատոգրաֆիան՝ զուգորդված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS), միջուկային մագնիսական ռեզոնանսի (NMR) ֆլուորեսցենտության չափման մեթոդների և Դիոդային զանգվածով զուգակցված բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա (HPLC):13-17 Այս ուսումնասիրությունը նկարագրում է կողմնակի արտադրանքի հայտնաբերումը և բնութագրումը վերջնական խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելում, որն առաջացել է ալկալային պայմաններում BDDE-ի և HA-ի ռեակցիայի արդյունքում:HPLC և հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիա (LC-MS վերլուծություն):Քանի որ BDDE-ի այս կողմնակի արտադրանքի թունավորությունը անհայտ է, մենք խորհուրդ ենք տալիս, որ դրա մնացորդների քանակականացումը պետք է որոշվի նույն ձևով, որը սովորաբար կատարվում է BDDE-ի վրա վերջնական արտադրանքում:
HA-ի (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) ստացված նատրիումի աղը ունի ~1,368,000 Da (Laurent մեթոդ) 18 մոլեկուլային զանգված և 2,20 մ3/կգ ներքին մածուցիկություն։Խաչաձև կապակցման ռեակցիայի համար BDDE (≥95%) գնվել է Sigma-Aldrich Co.-ից (Սենթ Լուիս, ԱՄՆ, ԱՄՆ):Ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթը pH 7,4-ով գնվել է Sigma-Aldrich ընկերությունից:LC-MS վերլուծության մեջ օգտագործված բոլոր լուծիչները, ացետոնիտրիլը և ջուրը ձեռք են բերվել HPLC որակի որակից:Մրջնաթթուն (98%) ձեռք է բերվում որպես ռեագենտի աստիճան:
Բոլոր փորձերը կատարվել են UPLC Acquity համակարգի վրա (Waters, Milford, MA, USA) և միացված են API 3000 եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրին, որը հագեցած է էլեկտրասփրեյ իոնացման աղբյուրով (AB SCIEX, Framingham, MA, ԱՄՆ):
Խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելների սինթեզը սկսվել է 198 մգ BDDE ավելացնելով 10% (w/w) նատրիումի հիալուրոնատի (NaHA) լուծույթին՝ 1% ալկալիի (նատրիումի հիդրօքսիդ, NaOH) առկայությամբ:BDDE-ի վերջնական կոնցենտրացիան ռեակցիայի խառնուրդում եղել է 9,9 մգ/մլ (0,049 մՄ):Այնուհետև ռեակցիայի խառնուրդը մանրակրկիտ խառնվեց և համասեռացվեց և թույլ տվեց 4 ժամ շարունակել 45°C ջերմաստիճանում:19 Ռեակցիայի pH-ը պահպանվում է ~12-ում:
Այնուհետև, ռեակցիայի խառնուրդը լվացվեց ջրով, և վերջնական HA-BDDE հիդրոգելը զտվեց և նոսրացվեց PBS բուֆերով՝ հասնելու HA-ի 10-ից 25 մգ/մլ կոնցենտրացիայի և 7,4 վերջնական pH-ի:Արտադրված խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելները մանրէազերծելու համար այս բոլոր հիդրոգելներն ավտոկլավացվում են (120°C 20 րոպե):Մաքրված BDDE-HA հիդրոգելը պահվում է 4°C ջերմաստիճանում մինչև անալիզը:
Խաչաձև կապակցված HA արտադրանքում առկա BDDE-ն վերլուծելու համար 240 մգ նմուշը կշռվեց և մտցվեց կենտրոնական անցքի մեջ (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, ԱՄՆ; ծավալը 0.5 մլ) և ցենտրիֆուգվեց սենյակային ջերմաստիճանում 10000 rpm-ով: 10 րոպե.Հավաքվել և վերլուծվել է ընդհանուր 20 մկլ քաշվող հեղուկ:
BDDE ստանդարտը (Sigma-Aldrich Co) ալկալային պայմաններում (1%, 0.1% և 0.01% NaOH) վերլուծելու համար, եթե բավարարված են հետևյալ պայմանները, հեղուկ նմուշը 1:10, 1:100 կամ մինչև. 1:1,000,000 Անհրաժեշտության դեպքում օգտագործեք MilliQ deionized ջուր վերլուծության համար:
Խաչաձև կապակցման ռեակցիայի մեջ օգտագործվող մեկնարկային նյութերի համար (HA 2%, H2O, 1% NaOH և 0.049 mM BDDE) վերլուծվել է այդ նյութերից պատրաստված յուրաքանչյուր նմուշի 1 մլ՝ օգտագործելով նույն անալիզի պայմանները:
Իոնային քարտեզում հայտնված գագաթների առանձնահատկությունը որոշելու համար 20 մկլ նմուշին ավելացվել է 10 մկլ 100 ppb BDDE ստանդարտ լուծույթ (Sigma-Aldrich Co):Այս դեպքում յուրաքանչյուր նմուշում ստանդարտի վերջնական կոնցենտրացիան 37 ppb է:
Նախ, պատրաստեք BDDE 11000 մգ/լ (11000 ppm) կոնցենտրացիայով BDDE լուծույթ՝ նոսրացնելով 10 μL ստանդարտ BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ ջրով (խտությունը 1,1 գ/մլ):Օգտագործեք այս լուծույթը 110 μg/L (110 ppb) BDDE լուծույթ պատրաստելու համար՝ որպես միջանկյալ ստանդարտ նոսրացում:Այնուհետև օգտագործեք միջանկյալ BDDE ստանդարտ նոսրացուցիչը (110 ppb) ստանդարտ կորը պատրաստելու համար՝ միջանկյալ նոսրիչը մի քանի անգամ նոսրացնելով, որպեսզի հասնեք 75, 50, 25, 10 և 1 ppb ցանկալի կոնցենտրացիան:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 1-ում, պարզվում է, որ BDDE ստանդարտ կորը 1.1-ից մինչև 110 ppb ունի լավ գծայինություն (R2>0.99):Ստանդարտ կորը կրկնվել է չորս անկախ փորձերի ժամանակ:
Նկար 1 BDDE ստանդարտ չափաբերման կորը, որը ստացվել է LC-MS վերլուծությամբ, որում լավ հարաբերակցություն է նկատվում (R2>0.99):
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, հեղուկ քրոմատոգրաֆիա և զանգվածային սպեկտրոմետրիա:
Խաչաձև կապակցված HA-ում առկա BDDE ստանդարտները և բազային լուծույթում առկա BDDE ստանդարտները բացահայտելու և քանակականացնելու համար օգտագործվել է LC-MS վերլուծություն:
Քրոմատոգրաֆիկ տարանջատումը ձեռք է բերվել LUNA 2,5 մկմ C18(2)-HST սյունակի վրա (50×2,0 մմ2; Phenomenex, Torrance, CA, ԱՄՆ) և անալիզի ընթացքում պահվել է սենյակային ջերմաստիճանում (25°C):Շարժական փուլը բաղկացած է ացետոնիտրիլից (A լուծիչ) և ջրից (լուծիչ B), որը պարունակում է 0,1% մածուցիկ թթու:Շարժական փուլը զտվում է գրադիենտ լուծմամբ:Գրադիենտը հետևյալն է՝ 0 րոպե, 2% A;1 րոպե, 2% A;6 րոպե, 98% A;7 րոպե, 98% A;7.1 րոպե, 2% A;10 րոպե, 2% A. Գործողության ժամանակը 10 րոպե է, իսկ ներարկման ծավալը՝ 20 µL:BDDE-ի պահպանման ժամանակը մոտ 3,48 րոպե է (փորձերի հիման վրա տատանվում է 3,43-ից մինչև 4,14 րոպե):Շարժական փուլը մղվել է 0,25 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ LC-MS վերլուծության համար:
BDDE վերլուծության և MS-ով քանակականացման համար UPLC համակարգը (Waters) համակցված է API 3000 եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրի (AB SCIEX) հետ, որը հագեցած է էլեկտրասփրեյ իոնացման աղբյուրով, և վերլուծությունը կատարվում է դրական իոնային ռեժիմում (ESI+):
Համաձայն BDDE-ի վրա կատարված իոնային հատվածի վերլուծության, ամենաբարձր ինտենսիվությամբ բեկորը որոշվել է որպես 129.1 Da-ին համապատասխան բեկոր (Նկար 6):Հետևաբար, քանակականացման համար բազմաիոնային մոնիտորինգի ռեժիմում (MIM), BDDE-ի զանգվածի փոխակերպումը (զանգվածից լիցքավորման հարաբերակցությունը [մ/ց]) կազմում է 203.3/129.1 Da:Այն նաև օգտագործում է ամբողջական սկանավորման (FS) ռեժիմ և արտադրանքի իոնային սկանավորման (PIS) ռեժիմ LC-MS վերլուծության համար:
Մեթոդի առանձնահատկությունը ստուգելու համար վերլուծվել է դատարկ նմուշ (սկզբնական շարժական փուլ):203.3/129.1 Da զանգվածային փոխակերպմամբ դատարկ նմուշում ազդանշան չի հայտնաբերվել:Ինչ վերաբերում է փորձի կրկնելիությանը, վերլուծվել են 10 ստանդարտ ներարկումներ 55 ppb (չափորոշման կորի մեջտեղում), ինչը հանգեցրել է մնացորդային ստանդարտ շեղմանը (RSD) <5% (տվյալները չեն ցուցադրվում):
BDDE մնացորդային պարունակությունը քանակականացվել է ութ տարբեր ավտոկլավացված BDDE խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելներում, որոնք համապատասխանում են չորս անկախ փորձերին:Ինչպես նկարագրված է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում, քանակականացումը գնահատվում է BDDE ստանդարտ նոսրացման ռեգրեսիայի կորի միջին արժեքով, որը համապատասխանում է եզակի գագաթնակետին, որը հայտնաբերված է BDDE զանգվածի անցման ժամանակ 203.3/129.1 Da, պահպանումով: ժամանակը 3.43-ից 4.14 րոպե Չսպասում:Նկար 2-ը ցույց է տալիս 10 ppb BDDE հղման ստանդարտի քրոմատոգրամի օրինակ:Աղյուսակ 1-ն ամփոփում է ութ տարբեր հիդրոգելների մնացորդային BDDE պարունակությունը:Արժեքի միջակայքը 1-ից 2,46 ppb է:Հետևաբար, նմուշում BDDE-ի մնացորդային կոնցենտրացիան ընդունելի է մարդու օգտագործման համար (<2 ppm):
Նկար 2 10 ppb BDDE տեղեկատու ստանդարտի իոնային քրոմատոգրամ (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) անցում, որը ստացվել է LC-MS վերլուծությամբ 203.30/129.10 Da (դրական MRM ռեժիմում):
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիաների մոնիտորինգ;MS, զանգված;m/z, զանգված-լիցքավորման հարաբերակցությունը:
Նշում. 1-8 նմուշները ավտոկլավացված BDDE խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելներ են:Հաղորդվում է նաև հիդրոգելի մեջ BDDE-ի մնացորդային քանակությունը և BDDE պահպանման ժամանակի գագաթնակետը:Ի վերջո, հաղորդվում է նաև նոր գագաթների առկայության մասին՝ պահպանման տարբեր ժամանակներով:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic թթու;MRM, բազմակի ռեակցիաների մոնիտորինգ;tR, պահպանման ժամանակ;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;RRT, հարաբերական պահպանման ժամանակ:
Զարմանալիորեն, LC-MS իոնային քրոմատոգրամի վերլուծությունը ցույց տվեց, որ հիմնվելով վերլուծված ավտոկլավացված խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելի նմուշների վրա, 2,73-ից 3,29 րոպե ավելի կարճ պահման ժամանակ կար լրացուցիչ գագաթնակետ:Օրինակ, Նկար 3-ը ցույց է տալիս խաչաձև կապակցված HA նմուշի իոնային քրոմատոգրամը, որտեղ լրացուցիչ գագաթնակետ է հայտնվում մոտավորապես 2,71 րոպե տարբեր պահման ժամանակ:Դիտարկված հարաբերական պահպանման ժամանակը (RRT) նոր դիտարկված գագաթնակետի և BDDE-ից գագաթնակետի միջև գտնվել է 0,79 (Աղյուսակ 1):Քանի որ մենք գիտենք, որ նոր դիտարկված գագաթնակետը ավելի քիչ է պահպանվել C18 սյունակում, որն օգտագործվում է LC-MS վերլուծության մեջ, նոր գագաթնակետը կարող է համապատասխանել ավելի բևեռային միացությանը, քան BDDE-ն:
Նկար 3 LC-MS-ով ստացված խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելի նմուշի իոնային քրոմատոգրամ (MRM զանգվածի փոխակերպում 203.3/129.0 Da):
Հապավումներ՝ HA, hyaluronic թթու;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիաների մոնիտորինգ;RRT, հարաբերական պահպանման ժամանակ;tR, պահպանման ժամանակ:
Որպեսզի բացառվի այն հնարավորությունը, որ դիտարկված նոր գագաթնակետերը կարող են լինել սկզբնապես օգտագործված հումքի մեջ առկա աղտոտիչներ, այդ հումքները նույնպես վերլուծվել են նույն LC-MS վերլուծության մեթոդով:Վերլուծված սկզբնական նյութերը ներառում են ջուր, 2% NaHA ջրում, 1% NaOH ջրում և BDDE նույն կոնցենտրացիայում, որն օգտագործվում է խաչաձև կապակցման ռեակցիայում:Օգտագործված սկզբնական նյութի իոնային քրոմատոգրամը որևէ միացություն կամ գագաթ չի ցույց տվել, և դրա պահպանման ժամանակը համապատասխանում է նոր դիտարկված գագաթնակետին:Այս փաստը մերժում է այն գաղափարը, որ ոչ միայն սկզբնական նյութը կարող է պարունակել որևէ միացություն կամ նյութ, որը կարող է խանգարել վերլուծության ընթացակարգին, այլև լաբորատոր այլ արտադրանքների հետ հնարավոր խաչաձև աղտոտման նշաններ չկան:BDDE-ի և նոր գագաթների LC-MS վերլուծությունից հետո ստացված կոնցենտրացիայի արժեքները ներկայացված են Աղյուսակ 2-ում (նմուշներ 1-4) և իոնային քրոմատոգրամը Նկար 4-ում:
Նշում. 1-4 նմուշները համապատասխանում են այն հումքին, որն օգտագործվում է ավտոկլավացված BDDE խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելների արտադրության համար:Այս նմուշները չեն անցել ավտոկլավացված:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic թթու;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիայի մոնիտորինգ:
Նկար 4-ը համապատասխանում է HA-ի և BDDE-ի խաչաձեւ կապակցման ռեակցիայի մեջ օգտագործվող հումքի նմուշի LC-MS քրոմատոգրամային:
Նշում. Այս բոլորը չափվում են նույն կոնցենտրացիայով և հարաբերակցությամբ, որն օգտագործվում է խաչաձև կապակցման ռեակցիան իրականացնելու համար:Քրոմատոգրամով վերլուծված հումքի համարները համապատասխանում են՝ (1) ջուր, (2) 2% HA ջրային լուծույթ, (3) 1% NaOH ջրային լուծույթ։LC-MS վերլուծությունը կատարվում է 203.30/129.10 Da զանգվածային փոխակերպման համար (դրական MRM ռեժիմում):
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic թթու;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիայի մոնիտորինգ:
Ուսումնասիրվել են այն պայմանները, որոնք հանգեցրել են նոր գագաթների ձևավորմանը։Ուսումնասիրելու համար, թե ինչպես են փոխկապակցված HA հիդրոգելի արտադրման համար օգտագործվող ռեակցիայի պայմանները ազդում BDDE խաչաձև կապող նյութի ռեակտիվության վրա, ինչը հանգեցնում է նոր գագաթների (հնարավոր կողմնակի արտադրանքների) ձևավորմանը, կատարվել են տարբեր չափումներ:Այս որոշումներում մենք ուսումնասիրեցինք և վերլուծեցինք վերջնական BDDE խաչմերուկը, որը մշակվեց NaOH-ի տարբեր կոնցենտրացիաներով (0%, 1%, 0.1% և 0.01%) ջրային միջավայրում, որին հաջորդեց կամ առանց ավտոկլավացման:Նույն պայմանները մոդելավորելու բակտերիաների ընթացակարգը նույնն է, ինչ օգտագործված մեթոդը՝ խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելի արտադրության համար:Ինչպես նկարագրված է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում, նմուշի զանգվածային անցումը վերլուծվել է LC-MS-ով մինչև 203.30/129.10 Da:BDDE-ն և նոր գագաթնակետի կոնցենտրացիան հաշվարկված են, և արդյունքները ցույց են տրված Աղյուսակ 3-ում: Նոր պիկեր չեն հայտնաբերվել այն նմուշներում, որոնք ավտոկլավացված չեն եղել՝ անկախ լուծույթում NaOH-ի առկայությունից (նմուշներ 1-4, Աղյուսակ: 3).Ավտոկլավացված նմուշների համար նոր գագաթները հայտնաբերվում են միայն լուծույթում NaOH-ի առկայության դեպքում, և գագաթնակետի ձևավորումը, կարծես, կախված է լուծույթում NaOH-ի կոնցենտրացիայից (նմուշներ 5-8, Աղյուսակ 3) (RRT = 0,79):Նկար 5-ը ցույց է տալիս իոնային քրոմատոգրամի օրինակ, որը ցույց է տալիս երկու ավտոկլավացված նմուշ NAOH-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիայի մոնիտորինգ:
Նշում. Վերևի քրոմատոգրամը. Նմուշը մշակվել է 0.1% NaOH ջրային լուծույթով և ավտոկլավացվել է (120°C 20 րոպե):Ներքևի քրոմատոգրամ. Նմուշը չի մշակվել NaOH-ով, այլ ավտոկլավացվել է նույն պայմաններում:203.30/129.10 Da-ի զանգվածային փոխարկումը (դրական MRM ռեժիմում) վերլուծվել է LC-MS-ով:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիայի մոնիտորինգ:
Բոլոր ավտոկլավացված նմուշներում, NaOH-ով կամ առանց դրա, BDDE-ի կոնցենտրացիան զգալիորեն կրճատվել է (մինչև 16,6 անգամ) (նմուշներ 5-8, Աղյուսակ 2):BDDE-ի կոնցենտրացիայի նվազումը կարող է պայմանավորված լինել այն հանգամանքով, որ բարձր ջերմաստիճաններում ջուրը կարող է գործել որպես հիմք (նուկլեոֆիլ)՝ բացելով BDDE-ի էպօքսիդի օղակը՝ ձևավորելով 1,2-դիոլ միացություն:Այս միացության մոնոիզոտոպային որակը տարբերվում է BDDE-ից և, հետևաբար, չի ազդի:LC-MS-ը հայտնաբերել է զանգվածային տեղաշարժ 203.30/129.10 Da.
Վերջապես, այս փորձերը ցույց են տալիս, որ նոր գագաթների առաջացումը կախված է BDDE-ի, NAOH-ի առկայությունից և ավտոկլավացման գործընթացից, բայց ոչ մի կապ չունի HA-ի հետ:
Մոտավորապես 2,71 րոպե պահման ժամանակ հայտնաբերված նոր գագաթնակետը բնութագրվեց LC-MS-ով:Այդ նպատակով BDDE (9.9 մգ/մլ) ինկուբացվել է 1% NaOH ջրային լուծույթում և ավտոկլավացվել:Աղյուսակ 4-ում նոր գագաթնակետի բնութագրերը համեմատվում են BDDE-ի հայտնի հղման գագաթնակետի հետ (պահման ժամանակը մոտավորապես 3,47 րոպե):Երկու գագաթների իոնային մասնատման վերլուծության հիման վրա կարելի է եզրակացնել, որ 2,72 րոպե պահման ժամանակով պիկը ցույց է տալիս նույն բեկորները, ինչ BDDE գագաթը, բայց տարբեր ինտենսիվությամբ (Նկար 6):Պահպանման ժամանակին (PIS) 2,72 րոպե համապատասխան գագաթնակետի համար ավելի ինտենսիվ գագաթ է նկատվել մասնատումից հետո 147 Da զանգվածում:Այս որոշման մեջ օգտագործվող BDDE կոնցենտրացիայի դեպքում (9,9 մգ/մլ), ուլտրամանուշակագույն սպեկտրում աբսորբցման տարբեր ռեժիմներ (UV, λ=200 նմ) ​​նույնպես դիտվել են քրոմատոգրաֆիկ տարանջատումից հետո (Նկար 7):Պիկը՝ 2,71 րոպե պահման ժամանակով, դեռ տեսանելի է 200 նմ-ում, մինչդեռ BDDE-ի գագաթը նույն պայմաններում չի կարող դիտվել քրոմատոգրամայում:
Աղյուսակ 4 Նոր գագաթնակետի բնութագրման արդյունքները մոտ 2,71 րոպե պահման ժամանակով և BDDE գագաթնակետին 3,47 րոպե պահման ժամանակով:
Նշում. Այս արդյունքները ստանալու համար երկու գագաթների վրա կատարվել են LC-MS և HPLC վերլուծություններ (MRM և PIS):HPLC վերլուծության համար օգտագործվում է ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման հայտնաբերում 200 նմ ալիքի երկարությամբ:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիաների մոնիտորինգ;m/z, զանգված-լիցքավորման հարաբերակցությունը;PIS, արտադրանքի իոնային սկանավորում;ուլտրամանուշակագույն լույս, ուլտրամանուշակագույն լույս:
Նշում. Զանգվածային բեկորները ստացվում են LC-MS վերլուծությամբ (PIS):Վերևի քրոմատոգրամ՝ BDDE ստանդարտ նմուշի բեկորների զանգվածային սպեկտր:Ներքևի քրոմատոգրամ. Հայտնաբերված նոր գագաթնակետի զանգվածային սպեկտրը (BDDE պիկի հետ կապված RRT-ն 0,79 է):BDDE-ն մշակվել է 1% NaOH լուծույթում և ավտոկլավացվել:
Հապավումներ՝ BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, հեղուկ քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա;MRM, բազմակի ռեակցիաների մոնիտորինգ;PIS, արտադրանքի իոնային սկանավորում;RRT, հարաբերական պահպանման ժամանակ:
Նկար 7 203.30 Da պրեկուրսոր իոնի իոնային քրոմատոգրամ, և (A) նոր գագաթնակետը՝ 2,71 րոպե պահման ժամանակով և (B) BDDE ստանդարտ գագաթնակետի ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման հայտնաբերումը 3,46 րոպե 200 նմ-ում:
Բոլոր արտադրված խաչաձև կապակցված HA հիդրոգելներում նկատվել է, որ LC-MS քանակականացումից հետո BDDE-ի մնացորդային կոնցենտրացիան եղել է <2 ppm, սակայն վերլուծության մեջ հայտնվել է նոր անհայտ գագաթ:Այս նոր գագաթնակետը չի համապատասխանում BDDE ստանդարտ արտադրանքին:BDDE ստանդարտ արտադրանքը նույնպես ենթարկվել է նույն որակի փոխակերպման (MRM փոխակերպում 203.30/129.10 Da) դրական MRM ռեժիմում:Ընդհանուր առմամբ, այլ վերլուծական մեթոդներ, ինչպիսիք են քրոմատոգրաֆիան, օգտագործվում են որպես սահմանային թեստեր հիդրոգելներում BDDE հայտնաբերելու համար, սակայն հայտնաբերման առավելագույն սահմանը (LOD) մի փոքր ցածր է 2 ppm-ից:Մյուս կողմից, մինչ այժմ NMR-ը և MS-ն օգտագործվել են խաչաձև կապակցված HA արտադրանքի շաքարային միավորի բեկորներում HA-ի խաչաձև կապակցման և/կամ փոփոխության աստիճանը բնութագրելու համար:Այս տեխնիկայի նպատակը երբեք չի եղել մնացորդային BDDE-ի հայտնաբերման քանակականացումն այնպիսի ցածր կոնցենտրացիաներում, ինչպիսին մենք նկարագրում ենք այս հոդվածում (մեր LC-MS մեթոդի LOD = 10 ppb):